临床微生物标本的采集和运送作为分析前质量控制的内容之一，往往会被忽视，而这对标本最终检测结果的质量却起着至关重要的作用！加强临床医生与检验工作者的沟通、定期对相关人员进行培训，尽可能在源头确保标本的质量，这样我们才有可能做到真正意义上的对标本负责，进而做到对患者负责！
呼吸道标本
?人类的上呼吸道有正常菌群栖居，而下呼吸道尤其在肺泡中正常情况下几乎是无菌的。
?不同部位的感染病原菌差异较大，上呼吸道感染多以病毒为主，下呼吸道感染病原菌多样，是最常见的呼吸道感染症。
（一）咽拭子
正常人上呼吸道鼻、咽、喉部有正常菌群。正常菌群或致病菌的正常携带与病原菌不易区分，所以不主张进行常规的鼻咽喉拭子培养，只进行特定微生物的检测（如化脓链球菌培养、淋病奈瑟菌咽拭子培养、溶血隐秘杆菌培养等）。
突发的咽痛、扁桃体肿大、颈部或颌下淋巴结肿痛，常伴有发热，通常没有咳嗽和明显的鼻溢。另外，有些感染相关性免疫异常的疾病也会要求做咽拭子培养，则根据化验单要求进行特定细菌的分离即可，例如化脓性链球菌。
采集前，患者应先反复漱口，仔细观察咽喉部，找到明显红肿化脓或者溃疡处。采集时，患者尽量张口，将舌向外伸，使腭垂尽可能向外牵引。医生挤压患处，并采集脓性渗出物，将棉签插入运送管，盖紧送检。
咽拭子标本的运送宜采用带保湿功能的运送培养基，避免由于送检时间过长而干燥。如未采用运送培养基，应于半小时内送检。即使采用运送培养基，室温保存也不应超过24小时。
1.标本标识不清；
2.标本干燥，容器破损；
3.送检时间超过2小时；
4.同时同一天两份或以上相同检测的标本（与临床医生协商后处理）拒收。
营养肉汤增菌后，用震荡器充分混匀，经接种口倒入痰液培养基，然后按程序放入自动化细菌分离培养仪中。
血平板
沙保弱，巧克力
（二）痰液★
痰培养仅用于下呼吸道感染，主要是肺部感染的诊断。但它不是最佳标本。血培养、肺泡灌洗液或经气管吸取物的培养结果更加准确。痰标本不能进行厌氧菌培养。
?咳嗽、脓性痰，伴有发热，影像学检查出现新的或扩大的浸润影；
?气道开放患者出现脓痰或血性痰；
?考虑下呼吸道感染患者采集痰液标本，同时送血培养标本。
由于肺链、流感嗜血杆菌、卡他莫拉等苛养菌是最常见的肺部感染病原体，标本盒内细菌在室温下很容易自溶死亡，如不能在采集标本后2小时内接种将明显影响检出率。因此痰标本的采集时机十分关键。
★遵循原则
1.争取在抗菌药物使用前采集；
2.标本采集后保证2小时内送达实验室并得到接种；
3.只要有可能得到合格的痰标本，应马上采集、送检；
4.宜在医务人员直视下留取合格痰标本；
5.送检痰标本后三天内不主张再次送检。
采集前准备无菌杯（螺口、有盖、密封）、清水。并向患者提供口头及书面采样指导，以保证患者充分理解口腔清洁、深咳、避免口咽部菌群污染的意义和方法。
①用清水漱口2-3次，再用力咳出深部脓痰；
②将痰液咳入无菌杯内；
③盖好并拧紧杯盖，尽快送达实验室。
1.标本采集后需尽快送到实验室，室温不能超过2小时。
2.不能及时送达或待处理标本应置于4℃冰箱保存（疑为肺链和流感嗜血杆菌等苛养菌不在此列），以免杂菌生长。但不能超过24小时。
1.质量不合格标本：显微镜下细胞学检查发现标本受口咽部菌群污染。合格痰标：本应鳞状上皮细胞＜10个/LP,白细胞＞25个/LP，或白细胞：鳞状上皮细胞＞2.5；
2.没有标签或标签贴错；
3.标识信息不明，未提供采集时间及送检目的等；
4.超过2小时送达实验室，且没有正确保存的标本；
5.运送容器有渗漏；
6.同一天同一项目重复送检的痰标本。
1.痰标本的前处理：①不含粘液的可以直接接种；②含黏液的，需用生理盐水洗涤3次，除去表面杂菌，再加痰液消化液，充分震荡摇匀后接种痰液培养基。
2.细菌鉴定
①细菌鉴定原理：为光电技术、电脑技术和细菌八进位制数码鉴定技术相结合的鉴定方法。
②药敏试验原理：按照比浊法原理，每15min以nm波长检测反应孔透光度，每孔在16个位置各检测3次，将药敏孔的透光度与对照孔对比，然后依据每孔抗生素的特殊算法将其初始资料计算成MIC值，并按照CLSI提供的折点报告其敏感（S）、中介（I）、耐药（R）结果。
①阴性培养结果报告
当培养足够时间未生长目的菌时，可进行阴性报告，如“经48小时培养无细菌生长”或“有正常菌群生长”。
②阳性培养结果报告
痰及呼吸道标本，培养出引起下呼吸道感染性疾病的病原体等具有临床意义。均应报告“XX细菌生长”及相应的药敏试验结果。
血液标本
?正常人的血液是无菌的。
?血流感染是一种危重的全身感染，血培养对感染性疾病的诊断、治疗和预后有重要的临床意义。
?血培养检测可以为临床进行血流感染和其他部位感染的诊断提供有力依据。
BloodStreamInfection，BSI
是指各种病原微生物侵入血循环，在血液中繁殖，释放毒素和代谢产物，并诱导细胞因子释放，引起全身感染、中毒和全身炎症反应，进一步导致血压下降、凝血和纤溶系统的改变，引起全身器官功能障碍的综合征。
当少量细菌侵入血液循环，为一过性，不繁殖或很少繁殖，不引起或仅引起轻微的炎症反应者称为菌血症,若有全身性炎症反应的表现称为脓毒症。
血液标本的细菌培养是诊断菌血症的基本而重要的方法，若从患者血液中检出细菌，一般视为病原菌感染，提示有菌血症。
常见的菌血症或脓毒症
1.葡萄球菌菌血症
由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）引起的菌血症和脓毒症逐年增多，占菌血症的10%~15%，临床表现明显，发病急，中毒症状重。
2.肠球菌菌血症
近年来明显增多，约占菌血症的10%。常见泌尿生殖道、消化道和腹腔感染的患者，易并发心内膜炎。此菌可对多种抗生素耐药，病情较重。
3.革兰阴性杆菌菌血症
主要侵犯危及机体免疫功能低下的患者。常可引起泌尿生殖道、胃肠道、胆道及呼吸道感染。
4.厌氧菌菌血症
厌氧菌常寄居于口腔、肠道和泌尿生殖道，并引起相应部位的感染。
5.真菌血症
常由条件致病性真菌引起，有假丝酵母菌、曲霉菌和毛霉菌等，以白假丝酵母菌最多见，多数伴有细菌感染。
①菌血症②感染性心内膜炎③导管相关血流感染
1.患者出现发热（≥38℃）或低温（≤36℃），或寒战；
2.白细胞计数升高（10×10^9/L），中性粒细胞升高；或白细胞计数降低（3.0x10^9/L）；
3.有皮肤黏膜出血、昏迷、多器官衰竭、休克等全身感染症状体征。
4.只要具备其中之一，又不能排除细菌、真菌血流感染的，就应进行血培养。
尤其伴有以下情况之一时，应立刻进行血培养：
1）医院获得性肺炎；
2）留置中心静脉导管、PICC等血管导管大于48h；
3）有免疫缺陷伴全身感染症状
1.采血时间★
?只要怀疑BSI，请立即采集血培养；
?采血培养应该尽量在使用抗菌药物之前进行，在1h内采集2～3次做血培养。如已经应用抗菌药物进行治疗，应在下一次用药之前采血培养。
?对间歇性寒战或发热应在寒战或体温高峰到来之前0.5～1h采集血液，或于寒战或发烧后1h进行。
?入院前两周内接受抗菌药物治疗的患者，连续3d，每天采2份。
※特殊患者血培养标本采集的时机?可疑急性原发性菌血症、真菌血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎或者肺炎，应在不同部位采集2-3份血标本；
?不明原因发热，如隐性脓肿、伤寒热和波浪热，先采集2-3份血标本，24-36h后估计体温升高前再采集2-3份；
?有临床指正，但血培养持续阴性，应该改变培养方法；
?怀疑细菌性心内膜炎，在1-2h内采集3份血标本，如果24h后阴性，应当再采集3份以上的血培养。
2.采集套数
成人每次应采集2-3套，每套从不同穿刺点进行采集，2d-5d无需重复采集。儿童通常仅采集需氧瓶。
3.采血量
成人每瓶采血量5-10mL，或按照说明书采集；婴幼儿及儿童采血量不应超过患者总血量的1%（通常2-4mL）具体采血量参考说明书。
若采血量充足，注射器采集的血液先注入厌氧瓶，后注入需氧瓶，蝶形针采集的血液反之。若采血量不足，优先注入需氧瓶。
4.采集方法
?采集静脉血
?穿刺点皮肤消毒
血培养瓶应在2h之内送至实验室孵育或上机；如不能及时送检，应将其置于室温下，切勿冷藏或冰冻。
由于血培养标本采取不易，且血流感染患者往往病情危重，实验室应尽可能接受血培养标本，并尽快进行培养检测。
以下情况可以接收但应告知申请医师：
（1）采血量不足；
（2）血培养瓶套数或瓶数不够；
（3）成人样本仅接种需氧或厌氧瓶。
血培养瓶种类
原理：当培养瓶中出现微生物时，它们利用培养基中的营养物质进行新陈代谢，在培养基中释放二氧化碳。培养瓶底部的传感器中含荧光物质和二氧化碳发生反应，释放荧光。在每个瓶位上，都有一个传感器测量荧光水平，而该荧光水平是和微生物释放的二氧化碳成比例关系的。在系统启动时，其内置的计算机进行自我诊断并将操作指令下达到抽梯状培养箱中。然后系统将执行自检。瓶位后的发光二极管照亮瓶位，激发培养瓶底部的荧光传感器。在经历了预热期后，设备中的传感器将获取读数。所有瓶位的一个检测周期将在10分钟内完成。阳性瓶将马上被瓶位前端的指示灯所标记，并有声音报警，且会在液晶显示屏上显示。
?每天检查，若报阳，涂片革兰镜检，发初步报告，并做好危急值记录；
?转种血培养基；
?革兰染色若为单一的细菌，直接抗菌药物敏感试验；
?选纯菌落，细菌鉴定和标准抗菌药物敏感试验。
注意：血培养污染★
?即使严格遵循无菌操作，仍有3%-5%的血培养瓶中培养出皮肤（如表葡、痤疮丙酸杆菌、梭菌、类白喉棒状杆菌）或周围环境（如不动杆菌属、芽孢杆菌属）中常见菌。这些菌大部分为污染菌，但出现以下情况考虑可能为致病菌：
（1）不同部位血培养标本培养出同一种菌；
（2）多次分离出同一种菌，且药敏结果相同；
（3）污染菌不需做药敏试验，但应向临床报告，并提示可能污染；
（4）血培养中两种或两种以上的细菌生长，可能是复数菌菌血症，也可能是污染所致。
①阴性结果报告：培养5天未见细菌生长和真菌生长
②阳性结果报告（三级）
初级报告：革兰染色特征和形态，阳性瓶数
中级报告：直接抗菌药物敏感试验和种属初步鉴定结果
最终报告：最终鉴定结果和标准抗菌药物敏感试验结果
脑脊液标本
?正常人的脑及脊髓是无菌的，任何细菌的检出均代表感染。（除非脑脊液受到污染）
?脑脊液是诊断中枢神经系统感染最主要的标本。
抽取脑脊液进行细菌学检验可为临床提供重要的诊断依据和抗感染治疗指导，明显改善病人预后，因此正确的脑脊液标本采集与处理十分重要。
1.发热等全身性感染症状；
2.头痛、喷射状呕吐、小而前囱饱满等颅内压升高症状；
3.颈项强直等脑膜刺激症状；
4.神经麻痹征等。
由临床医生进行，严格无菌操作：
1.2%碘酒严格消毒采集部位；
2.通常在第3、4腰椎或第4、5腰椎间隙插入带有管芯针的空针；
3.进针至蛛网膜间隙，拔去管芯针收集脑脊液5-10mL，分别置于3支无菌试管中，第一管做化学或免疫学检查，第二管做细菌学检查，第三管做细胞学检查。（参考自《临床微生物标本规范化采集和送检中国专家共识》医院感染控制分会年1月）
注意：为提高细菌培养的阳性率，应在抗菌药物治疗前采集标本，采集试管不应含防腐剂，进行脑脊液培养的同时，建议同时送血培养。细菌学检测要求脑脊液量≥1mL，真菌或抗酸杆菌≥2mL。
标本采集后应立即送检，不超过1小时；脑脊液标本不可冷藏，如不能及时送检应放置室温，时间不超过24小时。脑脊液如果用于病毒、真菌、分支杆菌检测应保存于4℃立即送达实验室。
1.容器上未贴标签，或标签与检验单不符；
2.标本外漏，容器破损或明显污染；
3.标本量少，送检延迟，未按规定保存。
（脑脊液、胸腹水等用培养瓶送检的，检测及报告同血培养，此不重述！）
泌尿道标本
正常人尿液是无菌的，而尿液细菌培养最大的问题是杂菌污染。正常人外尿道有大肠杆菌、葡萄球菌等存在，而这些细菌又是尿路感染中常见的病原菌。因此泌尿道细菌学检查，必须注意标本收集问题。
1.肉眼脓尿或血尿；
2.出现膀胱刺激征、血尿、肾区疼痛等症状、同时可能伴有寒战、高热、白细胞计数升高，怀疑存在泌尿系感染时；
3.尿常规结果提示泌尿系感染时；
4.留置导尿管患者出现发热时。
1.清洁中段尿：是泌尿系感染诊断的主要标本。
尽可能在未使用抗菌药物前送检，晨尿最佳。
采集方法如下：先用肥皂水清洗会阴部（男性应上翻包皮），然后用碘酒或碘伏消毒尿道口，最后用无菌干棉球擦干消毒剂，弃去开始的尿液，以冲刷尿道口的细菌，留取能代表膀胱部分病原菌的中段尿10~20ml，直接排入专用的无菌广口容器中。
2.导尿管采集尿液
因存在着极大的污染可能，禁止从集尿袋中采集标本。可直接穿刺导尿管近端侧壁采集尿液标本。
3.耻骨上膀胱穿刺
如需进行厌氧菌培养或儿童及其他无法配合获得清洁尿液标本时，应采用耻骨上膀胱穿刺。穿刺时膀胱应充盈，皮肤严格消毒后用装有19或20号针头的注射器在耻骨联合距脐1/3处穿刺。
采集后立即送检，室温夏季≤1h，冬季≤2h（东院）。如不能及时送检，应放4℃冰箱保存，但也不能超过24小时。
1.标识不明，未提供采集时间及采集方法；
2.标本类型与标签信息不符；
3.容器破损、尿液渗漏；
4.明显污染的标本；
5.标本量太少。
混匀，将尿标本经加样孔中倒1ml于尿液培养基，然后放入自动化细菌分离培养仪内。
血平板
沙保弱，中国蓝
①阴性报告：培养2天无菌落生长。
②阳性报告：细菌种属名、菌落计数、药物敏感试验结果；
菌落计数
接种量1vl，每ml尿液中的细菌数（CFU/ml）=平板上的菌落数x；
结果评价：
污染可能性大
中间二者皆有
感染可能性大
注意：菌落计数只有在镜下筛选合格的尿标本（WBC男性5/HP，女性10/HP，细菌相对单一的尿标本）中才有价值。三种以上细菌同时出现者提示污染，培养结果无意义。
胃肠道标本
?粪便是诊断胃肠道感染的最主要标本。肠道正常菌群复杂，在正常情况下，对人不致病。
?一旦失去了正常生态平衡，在临床上表现为菌群失调症，如常住细菌在种群和数量上的比例失调就能引起慢性腹泻。
?一些肠道致病菌（如霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌）可导致严重的急性腹泻，甚至危及生命。
当腹泻患者出现以下任何一种情况时建议采集粪便标本进行细菌培养
1.粪便涂片镜检白细胞大于5个/高倍视野；
2.重症腹泻；
3.体温大于38.5℃；
4.血便；
5.便中有脓液；
6.未经抗菌药物治疗的持续性腹泻患者。
1.自然排便法自然排便后，挑取有粘液、脓血部位的粪便（2-3g），液体粪便取取絮状物2-3ml，放置无菌容器内，或保存液或增菌培养基中及时送检。
2.直肠拭子法对于排便困难或婴幼儿，可用肥皂水清洗肛门周围，用无菌盐水、保存液或增菌液湿润的采样拭子或玻璃采便器插入肛门，成人4-5cm，儿童2-3cm，与直肠粘膜表面接触，轻轻旋转后取出，盛入无菌试管或保存液中送检。
1.置于无菌容器之粪便于室温可保存2小时，置4℃可保存24小时。
2.直肠拭子采集的标本必须置于运送培养基中送检，转运时间不宜超过24小时
3.高度怀疑霍乱弧菌感染的标本送检必须符合特殊标本的安全要求。
1.标本被尿液污染；
2.用卫生纸收集大便；
3.申请单信息不全、标识不符、送检容器不合格等。
GN肉汤增菌，充分震荡摇匀后，倒入粪便培养基，然后按程序放入自动化细菌分离培养仪。
血平板
沙保弱，ss琼脂平板
①阴性培养结果报告
由于分离粪便中的致病菌时，一般不可能提供各类菌种生长的必要条件，因此培养阴性结果不应采用“未检出致病菌”或“无致病菌发现”等报告方式，而应采用如“未检出沙门菌、志贺菌”和与此类似的其他菌检测的报告方式。
②阳性培养结果报告
报告方式应以分离的菌种的结果而定，如分离到沙门菌或志贺菌，霍乱弧菌等，并报告其血清学分型及药敏结果。其他细菌报告分离到XX菌，如做药敏试验应报告药敏实验结果。培养出霍乱弧菌、伤寒沙门菌、致病性大肠埃希菌O等应按传染病流程报告，并送当地疾病预防控制中心复核。
脓肿、创面分泌物及穿刺液标本
?脓液细菌学检查对于确定感染的种类、提供药物敏感结果、指导临床治疗有重要的意义。
?化脓性感染可由单种或多种细菌引起，正确的采集标本，对于确定病原菌起着重要的作用。
1.脓及创伤感染标本的采集
（1）用无菌生理盐水清洗病灶的杂菌，再采集标本，以免影响检验结果。
（2）一般用棉拭子采集脓液及病灶深部的分泌物，瘘管也可以无菌手续采取组织放入无菌试管内送检。
（3）脓肿标本以无菌注射器抽取为好，也可在切开排脓时，以无菌棉拭子采集，也可以将沾有浓汁的最内层敷料放入无菌平皿中送检。
2.穿刺液（胸腹水、心包液、关节液和深部脓肿等）标本的留取应由临床医生以无菌穿刺术抽取，胸腹水抽取量一般约为5-10mL，心包液、关节液等一般抽取量为1-5mL，将所得穿刺液注入血培养瓶中增菌或盛于含有无菌抗凝剂的试管或玻璃瓶中，充分混匀后立即送检。
1.对于厌氧菌的培养，必须用运送培养基或床边接种。
2.一般细菌培养，也应该尽早接种，室温下不超过2小时，最长不超过24小时。以免杂菌生长，影响结果的判断。
1.超过运送时间和污染的标本，以及留取不合格的标本；
2.对于无菌部位标本放入未经消毒的容器中送检的，拒收。
注意：
①穿刺液必须无菌操作，为了提高阳性率，需要增菌培养。
②脓液取材时，尽量取到有菌的部位。
③取材时，避免消毒剂的影响。
1.对于脓性拭子标本，经营养肉汤增菌后直接接种拭子培养基；
2.对于穿刺液标本，一般都建议抽在血培养瓶里（一方面起到增菌作用，另一方面培养时间较长5天，能够提高阳性检出率），然后按程序放入血培养箱进行培养。
血平板
念珠菌显色，MAC
案例分析
患者XX,男，40岁，因“颈痈术后15天，憋喘1天”入院。
现病史：患者15天前，因颈痈于XX医院行脓肿切开引流术，术后未予抗炎治疗。8天前因脓肿破溃，伤口未愈合，再次至XX院，予抗生素治疗8天未见明显好转。后因憋喘3小时，无胸痛胸闷，无头晕头痛，来我院急诊科就诊........
查体:神志一般，病程中患者感憋喘，精神差，嗜睡，大小便正常，食纳差，体重下降约20斤。皮肤黏膜无黄染，后颈部可见长10cm伤口，伤口周围红肿流脓........
实验室检查：骨髓穿刺示:粒细胞系统明显增生，中性粒细胞杆状核52%，为类白血病反应。
临床诊断：败血症
分析：检验结果显示：患者入院后WBC、CRP、PCT均增高且增高幅度较大，是典型较严重细菌性感染的表现，同时，患者同日血培养及脓液培养都检测出耐苯唑西林葡萄球菌，故临床高度怀疑患者是由于细菌感染而导致的败血症。
教师补充
1.加强与临床沟通，多送无菌部位的标本，对于感染诊断的价值大。
2.标本接种前，一定要进行评估是否合格。
3.改变临床送检误区，咽拭子作为上呼吸道采集的标本不应该作为下呼吸道感染的判断参考。
4.进行血培养标本采集时，若用注射器采集，则先接厌氧瓶，再接需氧瓶；若用蝶形针，则先接需氧瓶，再接厌氧瓶。
教师简介
检验医师，临床检验诊断学博士研究生在读，就职于医院检验科临床微生物室，主要从事医学检验本科教育和临床微生物多重耐药菌检测及耐药机制研究，发表相关论文多篇。先后获得江苏省新技术引进奖一等奖1项、徐州市新技术引进奖二等奖1项和徐州市科技进步奖三等奖1项，主持和参与市厅级课题多项。目前为医院感染控制分会感染与检验学组委员兼秘书长、江苏省免疫学分区域免疫与移植专业委员会委员。牛刀小试
1.人体正常生理状态时没有常居菌的器官是（）
A.眼结膜
B.肠道
C.肝脏
D.泌尿生殖道
E.鼻咽
2.常用下列方法采集尿标本作细菌培养（）
A清洁头段尿
B清洁中段尿
C留24h尿
D导尿
3.疑似流行性脑脊髓膜炎患者的脑脊液标本应注意（）
A置50%甘油盐水中保存送检
B冷藏送检
C立即接种于普通琼脂平板
D保温，迅速送检
4.A.-80℃冰箱
B.20℃冰箱
C.4℃冰箱
D.室温
E.37℃孵箱
?真菌培养后常保存于（）
一般常用细菌培养后大多保存于（）
5.细菌的孵育时间一般为（）
A.6-12h
B.12-18h
C.18-24h
D.1-2d
E.3d
6.常用于标本增菌的培养基是（）
A.血平板
B.麦康凯平板
C.巧克力血平板
D.营养肉汤
E.血液增菌培养基
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整理美编I蒋曼莉
审校I李洪春
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