一、目前形势和我们的任务
近年来，我国卫生管理部门对临床微生物学实验室的建设在不同时期提出了要求，促进了学科的进步和发展。年卫医院设置感染性疾病科和临床微生物室，配备感染专业医师、微生物检验专业技术人员和临床药师，对临床科室抗菌药物临床应用进行技术指导，加强临床微生物标本检测和细菌耐药监测。《抗菌药物临床应用管理办法》卫生部第84号令再次强调：医院应建立临床微生物室，开展微生物培养、分离、鉴定和药物敏感试验等工作，提供病原学诊断和细菌耐药技术支持，参与抗菌药物临床应用管理工作。
《“十三五”深化医药卫生体制改革规划》指出，年基本建立符合国情的分级诊疗制度。医院以常见病、多发病的诊断和鉴别诊断为重点；医院综合能力建设和学科建设，重点在常见病、多发病相关专业科室以及紧缺专业临床专科建设，逐步降低县域外就诊率。医院参与分级诊疗：收治疑难复杂和危急重症患者，逐步下转常见病、多发病和疾病稳定期、恢复期患者。
近十年来，我国医疗机构发展非常迅速，医院数量几乎翻倍，年初已达家，医院达家。国家卫健委宣布，医院要达到三级，医院（医院）医院要分别达到“医院”和“医院”服务能力要求。
面对国家医改大局，医院对感染性疾病诊断和治疗的需求，如何满足应对突发重大传染病的病原学诊断要求，是摆在我们临床微生物检验工作者面前的重大课题和挑战！
二、临床微生物室的作用及特点
随着医疗技术的不断进步，器官移植技术、各种介入性操作手段在临床的应用、抗菌药物的广泛使用造成各种耐药菌的传播，新发和再发感染性疾病的不断涌现，随着人群流动的频繁，原来局限的感染性疾病得以迅速播散，尤其是高致病性病原微生物对人类危害极大。临床微生物实验室在感染性疾病的诊断、治疗中处在“前哨”的位置。病原学诊断是感染性疾病诊断的金标准，只有确定了病原菌和药敏结果，临床医生才能真正做到选择正确的抗菌药物和合理用药。
1.临床微生物学实验室的主要作用：对感染性疾病作病原学诊断，提供药物敏感性试验结果，提供临床个体化治疗和用药依据；医院内感染的暴发，追溯传染源及其播散途径；监测病原菌的获得性耐药，指导临床经验性用药和监控抗菌药物的过度使用；参与疑难感医院的抗菌药物管理工作等。
2.临床微生物学检验的主要特点：（1）标本来源遍布全身各部位；（2）标本类型多样：液体、固体、半固体、植入体等；（3）分析前影响因素多，标本前处理、标本合格判断难度大；（4）病原体是未知的，有内源性感染和外源性感染；（5）病原体种类涵盖了微生物八大类：细菌、放线菌、真菌、支原体、衣原体、病毒、立克次体和螺旋体；（6）对技术人员的技能要求高：检验环节多，手工操作多，特别需要经验、专业基础知识及不断的知识更新；（7）不断出现的新病原、耐药菌变异；（8）需要综合运用传统微生物学技术、基于培养的蛋白组学、非培养技术包括核酸检测、免疫学等多种技术和方法；（9）需要有丰富专业经验的人员判断检验结果与感染是否相关；（10）与临床医生持续良好的沟通合作等。
三、美国临床微生物室的检测能力分级
美国CLIA’88法规中的能力测试（ProficiencyTestingPrograms，PTP），将临床微生物学（ClinicalMicrobiology）专业实验室分为5种亚专业实验室，每种亚专业有相应的能力等级划分，如规定细菌学分5级、分枝杆菌学（含结核分枝杆菌）分5级，真菌学分4级，病毒学分2级，还包括寄生虫学。各亚专业能力水平从低水平操作标本的镜检形态学解释结果、直接抗原技术检测某种病原体；标本接种培养后外送做鉴定和药敏试验；处理不同来源标本，从简单（尿、咽拭子、生殖道拭子、便等）到复杂类型（血液、脑脊液、组织、无菌体液、脓液等）；掌握不同病原菌的培养技术和方法的难易程度；从不同来源的标本分离的常见菌、少见菌、特殊菌能鉴定的属或种水平；可做常见病原菌的商品化药敏试验，到特殊菌的特殊药敏试验等诸方面，按操作的复杂程度，检测能力由低到高进行界定分级。并不是对实验室的能力一概要求，能力不足的就外送检验。是高大上还是小而全，要做卫生经济学评估，用最低的资源投入得到尽可能高的回报。
四、临床微生物实验室基本信息调查
1.微生物实验室数量及大小：今年9月，国家卫生健康委临床检验中心对参加全国临床微生物室间质评活动（高级）项目的实验室做了调查，家完成了问卷。其中所在医院实验室家，占80.9%，医院占64.67%（含三级特等6家），医院占15.28%，医院1.46%；所在医院占10.35%，医院占9.67%；第三方实验室占8.74%；通过ISO医学实验室认可的实验室家（19.29%）；参加全国细菌耐药监测网的实验室家（57.03%），参加省级细菌耐药监测网的实验室家（66.7%）。
2.医院实验室：医院微生物室占19.37%，市级占38.64%，地市级、县级和区级分别占14.27%、11.72%和11.57%，90家无行政级别。
3.微生物室总面积：小于60平米占28.47%，60-平米占58.86%，大于平米只占12.66%。马筱玲等《临床微生物学实验室建设基本要求专家共识》（以下简称“共识”）建议，三级、医院微生物室面积分别不低于平米和60平米。
调查数据主要反映了医院微生物室的现状，参加高级质评项目的医院微生物室，其能力基医院微生物检验最好水平。
4.微生物实验室人员：共识要求微生物室固定人员：医院至少3人，负责人至少是中级职称；医院至少6人，至少是副高职称。本次问卷调查显示：微生物实验室固定人员1-3人的占41%，5人以下的占77.24%，6人以上的只占22.51%，见图1。目前微生物室高级职称人数：无高级职称个（24%），有高级职称：1人/个，2人/个，3人/人，4人以上/个，职称人数分布百分率见图2。80%医院为主的调查，临床微生物室高级专业人才匮乏，整体行业人员明显不足。
5.基本设备情况：共识要求的二级、医院微生物实验室必备的基础设备的占有率：II级生物安全柜占99.5%，高压消毒灭菌器占96.92%；3台以上孵箱占71.29%，CO2孵箱占91.89%；2-8℃冰箱占90.17%，-20℃冰箱占83.25%，-40℃冰箱占18.31%，光学显微镜占98.58%，普通离心机占87.16%。医院微生物室必备的用于无菌体液形态学检验的细胞离心机25.14%；浊度仪88.96%，-80℃冰箱占66.60%；有条件的医院微生物室配备的设备：自动染片机33.54%，标本自动接种仪9.03%，飞行质谱仪30.22%，荧光定量PCR仪20.8%，测序仪2.0%，5.66%的实验室无以上设备。
以上数据显示，临床微生物室很多基本设备的拥有率偏低，有些甚至非常低，病原体检测的技术平台建设有待进一步加强。在专业技术人员严重匮乏的状况下，自动化程度如自动染片机、标本自动接种仪的分析前处理相关的配置严重不足，与微生物室投入产出比低有很大关系。当然，自动化程度与临床送检的标本量成正比，送检的标本量少，不良的循环导致很难发展。现状是医院微生物室通常1个技术人员，有的甚至还要兼科里的值班和其他室轮转，很多实验室往往一天只有不到10个标本。
五、临床微生物实验室的基本技术
临床微生物实验室应用的基本技术包括显微镜检验、微生物分离培养、鉴定、药敏试验、菌株的血清学分型等。这些技术不会因为技术的发展和进步而遭淘汰，其作用不能被分子生物学、免疫学技术和方法完全替代，是临床微生物室应对感染性疾病的基本和重要能力的体现。
（一）常用染色技术和方法
显微镜检测技术是临床微生物检验的最基本技术，也是实验室人员的基本功，需要长期的实践经验的累积，微生物检验中成本最低、速度最快的就是镜检方法。
1.不染色标本显微镜检验：湿片是不染色标本最常用方法，如对阴道分泌物直接观察假菌丝和孢子，诊断念珠菌性阴道炎；10%KOH湿片快速观察组织和体液中的真菌，如皮肤、指甲、活检材料和痰。
暗视野镜检适合对活细胞作不染色标本的显微观察。如肠道门诊开设的暗视野显微镜观察呈穿梭状动力筛查霍乱弧菌，并用特异性血清凝集做制动试验；观察特殊运动方式的密螺旋体，结合临床症状，即可初步判断为梅毒螺旋体。负染色方法如脑脊液墨汁染色用于检查新生隐球菌，当离心沉淀的脑脊液中发现有荚膜的酵母菌提示新生隐球菌，是诊断隐球菌性脑膜炎的常规方法。
2.鉴别染色方法：临床微生物室最常使用的鉴别染色方法有革兰染色、抗酸染色等，革兰染色结果解释包括染色特征和形态，用于细菌的形态学分类，还可用于临床标本的染色，包括识别宿主细胞类型和吞噬细胞。如痰涂片可见大量鳞状上皮细胞，表明标本被上呼吸道定植菌污染；根据白细胞的数量、存在肺泡巨噬细胞和柱状上皮细胞，可提示是合格的深部痰；在白细胞周围大量单一形态的细菌，与培养结果相对照，可提高培养方法的特异性及敏感性。白细胞内发现细菌提示活动性感染，如男性泌尿道脓性分泌物标本，在白细胞内找到革兰阴性双球菌可诊断淋病；阴道分泌物经革兰染色镜检，找到线索细胞提示细菌性阴道炎。
深部组织、分泌物培养时都应同时做革兰染色；脑脊液和无菌体液染色前需用细胞离心机甩片处理，将细胞与细菌分层以提高革兰染色的敏感性，缩短了TAT时间。血培养阳性标本、脑脊液标本直接涂片革兰染色，作为危急值一级报告，可尽早提供临床用药调整依据。
我国是肺结核高负担国家，抗击结核病任务艰巨。抗酸染色用于筛查致病性分枝杆菌的常规方法，但敏感性较低，金胺O或金胺-罗丹明染色可提高检出抗酸杆菌的敏感性，但需要用荧光显微镜观察。除分枝杆菌外，奴卡菌、马红球菌、军团菌（L.micdader）等，需用弱抗酸染色法。Giemsa染色法可观察细胞内结构，用于检测骨髓组织标本和白细胞中的可疑荚膜组织胞浆菌。
3.荧光染色：常见有荧光增白剂染色，直接检测脑脊液和其他体液的真菌，荧光染料与真菌和酵母菌的细胞壁结合，酵母菌和真菌显示白色荧光，但细菌和炎症细胞不被染色。
免疫荧光染色使用特异性抗体结合标本中的目标抗原，抗原-抗体复合物通过附着的荧光染料可被检测，有直接荧光抗体（DFA）和非直接荧光抗体试验（IFAT）。六胺银染色镜检是诊断引起艾滋病和其他免疫缺陷患者肺部感染的耶氏肺孢子菌（Pneumocystisjiroveci，PCP）的常规方法，因PCP在普通的培养基上不生长，理想的标本类型是肺泡灌洗液（BAL）、诱导痰或肺组织。
4.实验室开展常用染色方法的调查：本次问卷调查实验室开展常用染色方法如下：（1）开展最基本革兰染色方法的实验室占99.36%，本次调查未深入了解实验室是否对下呼吸道标本、无菌体液和脓等标本做常规涂片检验，根据平时的了解，如果临床不开镜检申请很多实验室不做检测，检验的质量将大打折扣，医院的信息系统设定解决，实验室人员严重不足，给涂片镜检带来很大困难；（2）开展抗酸染色占95.90%，金胺O（金胺-罗丹明）荧光染色的仅有7.47%，此方法可提高分枝杆菌阳性检出率十个百分点，有荧光显微镜的实验室占34.08%，但开展荧光染色的实验室比例更低；（3）开展检测脑脊液隐球菌的墨汁染色方法的实验室86.18%；（4）开展丝状真菌的形态学检测方法：棉兰染色法和10%KOH法分别为54.98%和50.58%。此外，共识建议的医院必开展荧光染色法的实验室仅占22.51%，检测耶氏肺孢子菌的六胺银染色占13.72%。
（二）临床微生物实验室分离培养技术
培养仍然是病原学诊断的金标准。尽管多年来诊断微生物学有了长足的发展，但在任何临床微生物学实验室，培养和分离技术在诊断大多数细菌和真菌感染方面一直占据着核心地位。实验室可处理标本的复杂程度、培养病原菌的难易程度是代表实验室能力的一个重要方面。引起人体感染的微生物有外源性和内源性，口腔、肠道、生殖道、皮肤等是人体的天然菌库，当这些部位的正常菌群易位到无菌部位，特别是来源于身体各部位的无菌体液、深部组织、深部脓液，往往有需氧菌和厌氧菌的混合感染，属于高度复杂感染的检验，感染病原学诊断的特异性也高。
在微生物培养中对营养苛求高的细菌被称作“苛养菌”，生长需要5-10%CO2环境，因此，微生物室必须配备CO2培养箱。根据微生物生长对气体的不同需求，分需氧培养、微需氧培养和厌氧培养。厌氧菌培养要求低氧化还原电势和特殊营养的培养基和无氧环境；微需氧菌包括弯曲菌、螺杆菌属等，其理想气体环境是混合气体中含5%O2、10%CO2和85%N2，培养需配置充气换气设备或采用商品化气体发生袋和密封罐装置。厌氧菌的革兰染色形态特异，如果这些特殊形态的细菌在需氧培养时不生长，可报告临床可疑厌氧菌感染，对医生的经验性治疗仍有较大帮助。实验室培养和分离病原细菌的能力与是否掌握以上的培养技术和配套设施密切相关，是微生物室核心能力。
本次问卷调查显示，有以下分离培养方法的实验室占比分别是：常见需氧菌94.58%，苛养菌84.03%，少见菌（包括棒状杆菌、奴卡菌、放线菌等）22.12%，分枝杆菌34.71%，厌氧菌60.64%，微需氧菌59.76%，酵母样真菌96.63%，丝状真菌68.06%。少见菌和分枝杆菌的分离培养率较低。
（三）基于培养的鉴定技术和药敏方法
1.全自动血培养仪：血培养方法仍然只能是诊断细菌血症和真菌血症的金标准。细菌血症和真菌血症的实验室检测始终是临床微生物室中最重要和复杂的角色之一，其导致的死亡率高达12%。菌血症的诊断需要从患者不同采血部位进行多次血培养，患者血液中的病原菌的数量少到甚至分子方法都检测不到，还不及培养方法敏感，血液中某些蛋白质和其他成分也抑制某些核酸扩增，并且在非菌血症患者体内误测到核酸可造成假阳性结果。本次问卷调查显示，三款国际主流品牌全自动进口血培养系统占86.62%，四款国产全自动血培养系统占15.92%。医院越来越重视菌血症的诊断，血培养送检的标本量逐年增加，医院有几套血培养仪。新一代自动上样的血培养系统的上市，更适合放置急诊、重症病房等区域，抽血后送至仪器平台，可自动扫描条码上样培养，单就这项进步已极大缩短了报告阳性血培养的时间，为挽救患者生命赢得了宝贵的时间。
2.基于培养物的鉴定系统：传统上，细菌和真菌的鉴定是基于常规生化管的反应，临床需要便捷的手工试剂盒和半自动检测鉴定系统提升标准化。80年代中期出现的自动鉴定药敏系统依靠微生物的生化特性、脂肪酸构成和其他代谢特性来鉴定，不同系统的菌种数据库可鉴定的细菌、酵母样真菌的种类和数量不同,用于临床实验室鉴定的系统菌库通常在-余种，自动化系统鉴定时间通常在16-24小时，非自动化鉴定系统培养时间4-48小时不等。
近年来推出的依赖于蛋白质组学技术的基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱（MALDI-TOFMS），提供了快速且廉价的细菌和真菌鉴定系统，可在几分钟之内完成对微生物的鉴定。组合的以核糖体蛋白质为主的谱峰型，经计算机软件将检测的质谱与参考谱数据库比对，根据匹配相似度的高低鉴定微生物的科、属种和亚种水平，现在的数据库可鉴定多属余种的菌种，并且还在不断扩展，比自动化鉴定系统扩展了对分枝杆菌、奴卡菌等放线菌、丝状真菌等类别菌的鉴定，质谱技术应用于对临床微生物的鉴定方法是划时代的革新。
本次问卷调查显示，有全自动鉴定药敏系统的实验室占84.66%，与调查的医院实验室占比相当，医院可达90%，医院可达到78%；进口半自动鉴定药敏系统占18.16%，国产半自动鉴定药敏系统占21.73%，在三级、医院实验室均有分布。有些医院微生物室拥有不止一种品牌的自动化鉴定仪，无自动鉴定系统的实验室有50家。
进口MALDI-TOF时间飞行质谱仪在我国与国际同时期上市，目前进口质谱仪实验室占有率在79.54%，国产质谱占有率20.43%，进口质谱仪占八成。作为补充鉴定的手工商品化试剂，当系统在鉴别遗传特征相近的微生物时，不能鉴定到准确的种水平，需要用到部分手工试剂。本次问卷调查显示，鉴定化脓链球菌杆菌肽纸片58.05%，厌氧菌分类纸片5.08%，检测产β-内酰胺酶的头孢硝噻吩纸片46.63%，鉴别肺炎链球菌的奥普托欣纸片78.59%，鉴别流感嗜血杆菌的XV因子纸片40.97%，无以上试剂的实验室占14.79%。当质谱仪、自动鉴定系统不能给出准确结果时，这些试验是重要的鉴别手段。
3．药敏方法与药敏标准：临床微生物实验室的主要功能之一是对有临床意义的细菌分离株做药物敏感试验，预测所检药物的治疗效果，提供临床个体化的精准治疗。药敏方法有参考方法，如微量肉汤稀释法，可准确检测最小抑菌浓度MIC值，是其他药敏方法的对照方法，需要严格的质量控制和熟练精确的手工操作，不适合一般实验室的常规使用。临床常规适用的药敏方法有：1）纸片扩散法：定性药敏试验，只给出敏感性结果，可自主灵活选择药物，不受新药和标准改变折点的影响，成本低，但不适用大部分苛养菌和少见菌及特殊标本来源的细菌/药物；2）自动仪器法：定量药敏试验，可检测MIC值，全自动药敏仪的专家软件系统对耐药表型结果分析并报告。只适用于常见需氧细菌和少数苛养菌，当药敏折点变化时，仪器的标准更新滞后，实验室应